灭菌方法通过物理或化学过程去除或破坏所有形式的微生物,包括病毒和细菌孢子。最常见的灭菌方法是在压力下用蒸汽灭菌。灭菌过程和设备由标准和法规组织(如CE Medical和FDA)监管和认证。在灭菌周期结束时,放置在灭菌机中的所有仪器都被完全灭菌。

介绍

图1和表格证明了微生物抗性的降低顺序,以消毒和灭菌和消毒水平或微生物营养阶段的平均热死亡时间和灭菌水平。1,2

到目前为止,还没有关于Covid19病毒在环境中存活的信息。然而,这一流行病表明它是相当稳定的,并且有来自同一家族的相关病毒的研究,例如SARS。该病毒的基因组序列表明它与2003年的SARS冠状病毒有80%的相似性。3.

说明1:微生物对消毒灭菌的抵抗力和消毒灭菌水平的递减顺序(1)
表1:微生物营养阶段的平均热死亡时间(2)
微生物类型 温度 时间[min]
非孢子形成细菌 58摄氏度 28.
非孢子形成细菌 61摄氏度 18.
孢子形成细菌的植物阶段 58摄氏度 19.
真菌孢子 76摄氏度 22.
酵母 59℃ 19.
病毒
---无信封 57摄氏度 29.
——包围 54摄氏度 22.
原生动物滋养体 46摄氏度 16.
原生动物囊肿 60°C 6.
虫卵 54摄氏度 3.
蠕虫幼虫 60°C 10.

室温下生存

对SARS和其他替代病毒进行了存活研究,结果表明:20℃时病毒存活率为0.5%;体液、痰、血清和体表-4天;呼吸道分泌物–4-5天3.;在塑料材料上干燥 - 6-9天;在多孔材料上干燥(纸) - 4天4..在4°C时,存活时间较长,长达4周4.

高温存活率

病毒在56°C、67°C和75°C下的存活时间分别为90分钟、60分钟和30分钟。根据研究4.,对于56以上的每10度上升,每10度高于56,杀死此病毒的杀死时间以完全失活(至少6个日志),显着缩短。人们可以推断出100°C,杀戮时间将在5-7分钟内。

Tuttnauer推荐工艺

基于以上,已被推荐5.在常规灭菌循环之前,在100℃下进行7分钟的预热阶段,以使各种表面上的SARS-CoV-2失活5.

将预热阶段添加到灭菌循环中,以最小化空气污染的风险,例如SARS-COV-2,特别是在某些灭菌循环的第一阶段期间可能发生的,特别是在高压釜中近距离高压釜。预热阶段参数在103°C的最低温度下为15分钟。

在这种预热阶段,在环境中没有空气耗尽。一旦完成预热阶段,标准和调节的灭菌循环开始。

目前试验的目的是证明这种额外的预热阶段可以成功地对营养细菌进行消毒,模拟病毒污染。

材料与方法

菌株和培养物制备-生物实验

患有绿色荧光蛋白(超级夹GFP,SFGFP)的枯草芽孢杆菌菌株从芽孢杆菌遗传股票中心获得(http://www.bgsc.org)。B.枯草芽孢杆菌菌株(基因描述符,TRPC2,AMYE:(PVEG(+ 1 / + 8)_R0_SFGFP_SSRA(SVN)_SPEC),BGSCID 1A1270)接种到100ml LB肉汤中,含有100μg/ ml柿子霉素,并在37℃温育过夜°C摇晃。将1.5ml细菌培养物的样品加入EPPendorf管中并以13000rpm离心3分钟。除去上清液,将细胞重新悬浮在500μl新鲜的LB中。将B.枯草芽孢杆菌细胞悬浮液转移到20mL玻璃闪烁小瓶中,置于具有金属载荷的小袋中,并立即插入高压釜中。将具有相同细菌浓度的另外的样品作为对照留下。

电池电镀和计数

在新鲜LB培养基中连续稀释枯草芽孢杆菌培养VA。将20μL的库存细胞培养物稀释成1980μl无菌培养基,形成×100稀释。连续稀释为×4000,×160,000和×6,400,000。为了估计细胞群,从×160,000稀释率和100μl×6,400,000的50μl样品各自在含有100μg/ ml柿子霉素的固体LB琼脂平板上涂布。

平板在37℃下培养过夜,随后计数菌落。对于每个试验循环,该程序重复3次,即
预热窗口(最低温度103°C下15分钟),无空气排放到环境中。高压灭菌器处理(预热窗口)后的样品在不稀释的情况下进行电镀。

从高压灭菌器中取出100 μl的培养物,将其放在含有100 μg/ml大典霉素的LB琼脂平板上。培养皿37°C孵育过夜,随后计数菌落。每个循环重复3次,每个循环包含3个细菌样本。

预热阶段处理后的培养样品

治疗后的细菌培养物,一旦除去用于细胞计数的样品,将含有含有100μg/ ml的含有100μg/ ml呈态度霉素的6mL新鲜无菌LB液体介质的管中。在孵育之前,在600nm(OD600)下测量光密度。将管在37℃温育24小时。孵育后,再次测量样品的OD600以暗示细菌生长。

验证完整的灭菌周期

没有必要验证完整的常规蒸汽灭菌循环,因为它是一种经过验证的和完全有效的众所周知的方法。

结果

初始细胞群见表2。周期处理前每个初始样品的细胞计数平均为7.6×10每个闪烁瓶8个细胞。

表2:初始细胞群CFU计数
样品编号 CFU,×160000稀释,50μl电镀 CFU,×6.4E6稀释,100μl电镀 平均细胞计数
示例1 255个殖民地 12个殖民地 7.92×108电池
示例2 272个殖民地 14个殖民地 8.8×108个细胞
示例3 212殖民地 9个殖民地 6.3×108电池
图1.显示CFU计数的标牌。样品2:左平板细胞×160000稀释后计数272个菌落,右平板细胞×6400000稀释后计数14个菌落

预热窗口电镀

在表3中展示了在没有空气中的预热窗中(最小温度为103℃的最小温度为103℃)的高压釜中处理的等效样品。如可以看出,处理的样品当镀在固体LB琼脂板上而无例外时没有表现出细菌生长。

表3:在没有排气的情况下,预热(至少103°C下15分钟)后细菌生长的电镀结果
循环编号。 样品1(100μl) 样品2 (100 μl) 样品3(100μl) 对照(未处理)(100 μl)
1 无增长 无增长 无增长 生长
2 无增长 无增长 无增长 生长
3. 无增长 无增长 无增长 生长
蒸压循环后的细菌培养物的电镀
图2所示。蒸压循环后的细菌培养物的电镀。左平板-无菌落,表明细菌细胞完全失活。右培养皿,未处理培养物的对照样本-菌落全覆盖。

将热处理后的剩余细菌样品转移到新鲜的LB培养基中不会导致细菌生长。剩余的细胞悬液(电镀后)在液体培养基中培养并培养48小时。在孵育期间,对所有样品的光密度OD600进行常规检查。在所有受试样品中未观察到OD600的变化,表明缺乏细菌生长。

总结和结论

目前测试的目的是证明添加的预热阶段可以成功消毒模拟病毒污染的营养细菌。

在灭菌周期中增加了预热阶段,以便在高压灭菌器中某些灭菌周期的第一阶段,将可能发生的空气污染(如SARS-CoV-2)的风险降至最低,特别是在靠近高压灭菌器的地方。

使用模拟病毒污染的生物负载测试预热阶段(最低温度103°C下15分钟)。试验负载的活营养菌浓度高于1×10 6个细胞,在预热阶段失活。

在所有测试周期中没有记录细菌生长的证据。

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关于Tuttnauer

Tuttnauer为牙科和眼科诊所提供端到端无菌处理解决方案,包括:;先进的高压灭菌器,洗衣机消毒器,指标,无菌加工产品。新的B级高压灭菌器与病毒防护罩是一个高度先进的高压灭菌器显着开发的牙科,眼科和医疗实践提供了一个额外的保护层。高压灭菌器通过满足所有灭菌需求和创建适应最具挑战性负载的循环参数,确保负载无菌性,高效干燥,帮助牙医实现当今具有挑战性的工作负载,并提供优质的患者护理,而不存在跨患者污染的风险,从而超越了标准。

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参考文献

  1. 微生物对消毒灭菌的抵抗力和消毒灭菌水平的递减顺序疾病控制和预防中心,国家新发和人畜共患传染病中心,卫生保健处。2008年美国疾病控制与预防中心卫生保健设施消毒和消毒指南
  2. 微生物营养阶段的平均热死亡时间.Talaro,陷入;国际象棋,b;“微生物学基础”,微生物控制的物理和化学制剂,第七版,第11章,McGraw-Hill公司,2008
  3. 凝胶,c;Varbanov m;杜瓦、再保险;《人类冠状病毒:洞察环境抗性及其对新防腐策略发展的影响》,2012年11月12日;4(11):3044-68。doi: 10.3390 / v4113044。
  4. 卡萨诺瓦,LM;Jeon,S。;鲁塔拉,华盛顿州;韦伯,DJ;医学博士索布西空气温度和相对湿度对冠状病毒在表面存活的影响”,应用环境微生物学。2010年5月;76(9):2712-7.doi:10.1128/AEM.02291-09.Epub 2010年3月12日。
  5. SARS-CoV-2的热灭活.EITAN以色列,热量过程失活推荐,以色列Biohazard Ltd.,推荐信,2020年。